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真菌毒素检测技术与产品服务（1）
时间：2009/3/27      阅读：2699

 液相色谱法测定谷物中赭曲霉毒素含量

 
摘要：研究了液相色谱法测定谷物中赭曲霉毒素的方法。样品经乙腈水（84：16）提取，提取液通过PuriToxSR 130赭曲霉毒素净化柱净化、浓缩，C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。对添加两个浓度赭曲霉毒素的玉米样品进行加标回收实验，平均回收率为99.12%和103.09%，变异系数分别为0.281%、1.214%，zui低检测限为0.20ng/kg，方法简便易行，准确精密度高，值得推广。
 
Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in grains .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with    ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are   satisfactory.
 
霉菌遍布世界各地，种类繁多，依生活习性，分为仓储霉菌和田间霉菌。赭曲霉毒素（简称OTA）是温暖地区zui重要的仓储毒素，广泛存在于玉米、大麦、小麦和饲料中,麸皮的污染高于整粒谷物。在热带和亚热带地区主要由曲霉菌产生，而温暖地区则由青霉属产生。广东地处亚热带，温湿度十分适宜霉菌的生长，据有关调查该毒素污染在饲料原料和配合饲料中普遍存在，阳性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，据报道，每千克饲料中含有0.2-0.3克，就可使鸡中毒，zui常见的临床表现有：钙磷吸收障碍，骨骼脆弱，蛋壳钙化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫伤。对家畜主要攻击肾脏、免疫系统和造血系统，肝脏变得脆弱，剧渴，生长迟缓，多尿、下痢、糖尿症。癌症研究机构（IARC）已证明OTA对人可能是致癌的。有建议指出OTA引起地方肾病和膀胱肿瘤。但 FAO/WHO专家协会指出，以上这些结论证据不足，其他的肾毒性可能起着重要作用（WHO2002）。一些国家已经制定*，欧盟对麦片的*是5ug/ml3.根据中国国家有关规定，玉米中赭曲霉毒素的zui高*为：20ug/kg.
现常用的检测方法多为薄层色谱和酶联免疫法，薄层色谱法操作繁琐，污染大、定量差，耗时长，而酶联免疫法虽操作简单，但存在假阳性，准确性欠佳，此液相色谱法操作简便，快速，准确灵敏度高，不失为一种好方法。
1.实验部分：
1.1试剂和仪器
乙 腈（色谱纯）  冰醋酸（分析纯） 去离子水
赭曲霉标准液：10ug/ml 溶剂为乙腈
PuriToxSR 130赭曲霉毒素净化柱
Waters2695液相色谱仪
荧光检测器
1.2步骤
1.2.1  取样：取代表样品5kg，粉碎，充分混合均匀，四分法缩至500g, 因霉菌毒素分布不均匀，充分混合非常重要，必要时取样量加大，有地方建议取15kg。
1.2.2  提取：取25g粉碎样品于250ml三角烧瓶内，加100ml乙腈水（84：16），在振荡器上振荡1小时，用定量滤纸过滤。
1.2.3  标准准备：将50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一个棕色瓶子里吹干，用10ml的流动相进行溶解，涡旋1分钟，此为50ng/ml的赭曲霉毒素标准液；另将1 ml10ug/ml
的赭曲霉毒素在一棕色瓶子内吹干，用10ml的流动相溶解，涡旋1分钟，此为1ug/ml的赭曲霉加标标准溶液。
1.2.4   净化浓缩：取7ml的样品提取液进一玻璃试管内（与前处理柱配套提供）
（加标时取7ml的空白样品分别加10ul和35ul的1ug/ml的赭曲霉标准溶液）,加70ul的冰已酸，混合，用PuriToxSR 130赭曲霉毒素净化柱净化萃取液,然后将净化液，转移4ml的净化液到另一试管，60℃水浴中氮气吹干，用400ul的流动相（60/40/1水/乙腈/乙酸）溶解，涡旋30min ，转移到1.5ml的离心管内10000rpm离心5分钟，转移350ul 的清洁样品进入液相。
 
1. 3仪器条件
 
Waters2695液相色谱仪，2475荧光检测器
色谱柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm   Waters PAHC18（5um）4.6*150mm
流动相：60/40  水/乙腈
流速：0.5ml/min  运行时间：20min
柱温：40℃
进样体积：60ul
EX:330nm      EM:460nm
 
2. 0测定结果
 
2.1 标准曲线及回归方程：取制定好的50ng/ml的标准溶液，用流动相分别稀释成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的浓度，制成标准曲线。
 
表1.   标准曲线的基本参数：

浓度范围
1.0
2.0
5.0
10.0
20.0
30.0
50.0
峰面积
103454.993
210799.985
515389.964
1064099.926
2285364.840
3442139..760
5463738.891
相关系数
0.9995
回归方程
Y=1.11×105X-1.85×103
检测限
0.20ng/kg（按3倍信噪比计算）

 
 
 
2.2不同浓度添加回收实验：取玉米样品1份，分别做两个浓度的加标回收实验，结果见表2。
表2.两个浓度的样品添加回收实验结果表：

组分
本底值
添加标准液的体积
10ul
35ul
赭曲霉毒素
0
添加处理后理论浓度
14.28ng/ml
50.0ng/ml
添加次数
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
添加后测得浓度（ng/ml）
14.18
14.16
14.13
14.20
14.10
52.06
52.16
51.13
51.68
50.69
回收率
99.30
99.16
98.95
99.44
98.74
104.12
104.32
102.26
103.36
101.38
平均值
99.12
103.09
RSD（%）
 
0.281
 
1.214

 
2.3精密度实验：选择不同含量的玉米样品两份，分别平行测定8次，结果见表3
 
表3.精密度实验结果

检测次数
1
2
3
4
5
6
7
8
平均值
RSD
样品1测定值
11.23
11.46
11.41
11.36
11.87
11.97
11.67
11.75
11.59
2.27
样品2测定值（ng/ml）
28.57
28.62
28.68
28.98
28.87
28.12
28.92
28.53
28.66
0.963

3.0结论：
 
此方法简便易行，快速准确，灵敏度高，检测限低，适合大批量检测，值得推广
 
 
4.0参考文献：
王若军,苗朝华,张振雄.中国饲料及饲料原料受霉菌毒素污染的调查报告.<<饲料工业>>2004.2（21）.:25
（3）G.. Buttinger, E.Fuchs,H.Knapp,F.Berthiller,2004,Performance of new clean-up column for the determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD.Food Additives and Contaminants,11,1107-1114.
 
 
 

 

 

 

 

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