检测范围：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低检测限：7.8 pg/ml
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的小鼠TNF-α，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期：6 个月
预期应用：ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中TNF-α
含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任
何影响。
概述
小鼠ELISA试剂盒 是一种具有多种生物活性的细胞因子。兔子TNF-α
基因编码前体蛋白，其信号肽将前体蛋白固定在细胞膜上，成为具有活性的跨膜干扰素
（TNF），分子质量为26×103，经酶切去除信号肽生成分泌型TNF-α，分子质量为17×103。
TNF-α细胞来源广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、
平滑肌细胞、星形细胞、成骨细胞等。
TNF-α具有广泛的生物学活性，如：参与炎性反应和免疫应答，抗肿瘤，参与内毒素性休
克等病理过程，引起恶病质等。其具有双重作用，,一方面在机体免疫调节，机体生理功能
和抗感染等方面发挥重要作用，另一方面若持续释放或产生过多则会引起发热!、休克、恶
病质等，同时TNF-α可进一步诱导IL-6、IL-8、IL-10 等细胞因子的产生，这些促炎性细胞
因子参与体内急性反应、发热反应、引起趋化肽释放等，还可使内皮细胞活化而导致血管通
透性增加。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗TNF-α抗体的微孔中依次加入标本或标
准品、生物素化的抗TNF-α抗体、HRP 标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB 显色。
TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的。颜色的深浅
和样品中的TNF-α呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓
度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96 孔）。
2. 标准品（Standard）：2 瓶（冻干品）。
3. 样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。
10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof 管
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5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃后于1000 x g 离心20 分钟，取上清即可
检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8° C 1000 x g 离心15
分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将标本
放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则：
小鼠ELISA试剂盒  首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准
曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度
时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上，
然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2000 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释2000
pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，样品稀释液
直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15 分钟内配制。
如配制1000 pg/ml 标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2000 pg/ml 的上述标准品加入含0.5ml
样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制
（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素标记抗体加990ul 生物素标
记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：
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临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的
总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根过氧化物酶标记亲和
素加990ul 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内
配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试
剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标
准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，
轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120 分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100ul（取1ul 生物素标记抗
体加99ul 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60
分钟。
3. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分钟，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100ul，37℃，60
分钟。
5. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分钟，350ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4 孔
有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转）。终止液的加入顺序应尽量与
底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。在加终止液后15 分钟以内进
行检测。

注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。
测量时先用此孔调OD 值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过
氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生
物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，
酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟。根据需
要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上
绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准
物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出
样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
小鼠ELISA试剂盒 注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
北京方程生物
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。