ELISA试剂盒此刻酶催化无色的底物生成有色的产品。反响的温度和时刻仍是影响显色的要素。在必定时刻内，阴性孔可坚持无色，而阳性孔则随时刻的延伸而呈色加强。恰当进步温度有助于加速显色进行。在定量测定中，参加底物后的反响温度和时刻应按规则力求。ELISA试剂盒时刻通常不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色状况恰当缩短或延伸反响时刻，及时判别。
OPD底物显色通常在室外温或37 ℃反响20-30分钟后即不再加深，再延伸反响时刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反响应避光进行，显色反响结束时参加停止液停止反响。OPD产品用硫酸停止后，显色由橙转向棕。
TMB受光照的影响不大，ELISA试剂盒可在室温中置于操作台上，边反响调查成果。但为确保实验成果的稳定性，宜在规则的恰当时刻阅览成果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达，随即逐步削弱，至2小时后即可*衰退至无色。TMB的停止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反响停止。这类停止剂尚能使蓝色保持较长时刻（12-24小时）不褪，是目视判别的杰出停止剂。此外，各类酸性停止液则会使蓝色转变成，此刻可用特定的波长（450 nm）测读吸光值。
ELISA试剂盒比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的实验，需先将板置于规范96孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边际剪净，这样，此板就可*平妥坐入座架中。